热疗研究常用的方法
2.2测定细胞雕亡的方法
加温引起细胞周期阻滞并引发细胞凋亡，凋亡细胞的定性和定量测定可以作为评定细胞热效应的客观指标。
2.2.1光学显微镜下观察细胞凋亡
凋亡细胞的组织学变化表现为：只发生在单个细胞或几个细胞而周围细胞是完好无损的并无炎症反应表现。在光学显微镜下凋亡细胞最主要的变化是核内染色质的浓缩，形成染色质块，并贴在核的边缘，呈现月牙形或沙丘状。进一步则呈分叶状或花瓣状，最后分离形成多个核碎片。细胞胞质固缩，体积缩小，细胞表面起泡，成不规则形状。凋亡小体出现，并可见凋亡小体被周围巨噬细胞吞噬现象。通过计数凋亡细胞，可以计算凋亡指数（apoptoticindex）。
2.2.2流式细胞分析法
流式细胞术（FCM,flowcytometry）是对单细胞多项特征进行快速测定的生化技术。其原理为：经过特异的荧光染料染色的单细胞悬液受到一束预定波长的激光照射时可以发出荧光，荧光的强度与所染物质的量成正比，因此，测出荧光强度即可得知所测物质的相对含量，若将受激产生的荧光，经光电倍增管接收放大，并送电子计算机处理即可得出所需参数。细胞经DNA荧光染料（如碘化丙啶）标记后，FCM可测定单个细胞DNA含量，经电子计算机处理可得出细胞群DNA含量的分布图，亦称细胞周期直方图（见图3.2.1），直方图的横坐标表示DNA含量，纵坐标表示细胞出现的频率，即相对细胞数。左边第一峰是由G1和G0细胞组成，右边小峰由G2和M期细胞组成，中间部分是S期细胞。如果在G1峰前出现Sub-G1峰，它是由带有DNA降解的凋亡细胞组成。经计算机软件处理可计算出G0/G1、S、G2/M各细胞周期细胞所占比例和Sub-G1凋亡细胞的比例（见表3.2.1）。
将细胞消化后离心，沉淀后用70%冰乙醇固定，于40C下过夜，离心，用PBS液洗2遍，加RNA酶（50ug/ml）、370C作用１小时，再用PI溶液（100ug/ml）染色DNA30分钟，在流式细胞仪上进行分析。
2.2.3DNA片段化分析法（DNAladder）
细胞凋亡的最后通路是细胞染色质DNA特征性的片段化降解。细胞发生凋亡，其DNA的降解不是随机位点上发生断裂，而是在两个核小体（nucleosome）之间的连接部位发生断裂。所以这些DNA片段就是在形态学上出现若干大小不一的由180个碱基对的整倍数的寡核苷酸片段组成。因此，从发生细胞程序化死亡的细胞中提取染色体DNA，进行琼脂糖（agarose）凝胶电泳时，能观察到呈不连续但具有特定大小的条带状，称为云梯（ladder）状。这是细胞程序化死亡最重要的生物化学特征之一，也是DNA片段化分析法检测细胞凋亡的原理。该法是先用酸或氯仿提取DNA，再用乙醇沉淀，在明胶板上进行电泳后，用溴化乙锭着色，出现特征性的DNA梯形条带。此法敏感性不高，需要106个以上细胞。
2.2.4原位末端标记检测凋亡效应（TUNEL分析）
这是一种对单个细胞通过显示DNA的降解来检测凋亡的技术，属于原位末端标记技术（insituendlabelingtechniques,ISEL）中的一种。该法是对细胞经甲醇固定处理后，滴加转化剂－POD,苏木精复染，用DNAaseI处理细胞，使之产生DNA链缺口，再滴加TUNEL反应混合液。以细胞出现棕黄色颗粒为阳性凋亡细胞，每张细胞片选择3个区在300倍视野下连续计数200个细胞，计算其中凋亡细胞的百分率。
第2章加温后的生物学改变
3.2分子，基因水平
热疗的作用靶是真核细胞的核染色体具有双螺旋结构的DNA，产生单链断裂（可修复）和双链断裂（不可修复）。加温诱导产生的热休克蛋白70（HSP70,heatshockprotein）都有促进细胞损伤修复的作用；另一方面，加温也使细胞内溶酶体酶活性增加，其崩解释放的消化酶使损伤细胞蛋白消化溶解。加温诱导产生的肿瘤坏死因子a（TNFa,tumornecrosisfactor）对细胞凋亡起促进作用。加温尤其是在高温下，细胞内DNA损伤修复的聚合酶活性下降，使加温所致DNA损伤修复受阻。加温产生细胞周期阻滞，由此启动修复过程，如果细胞损伤不能修复，将引发细胞程序化死亡过程，即凋亡发生。P53抑癌基因对加温后细胞周期阻滞和凋亡都起着重要的调控作用。
P53基因位于人17号染色体上（17p13.1），因编码一分子量53KD的核磷酸蛋白而得名。P53基因全长约20kb，有11个外显子，10个内含子，编码393个氨基酸。P53蛋白有三个结构区：N－末端为酸性区，具有转录激活功能，可与许多转录因子相互作用；中央疏水区富含脯氨酸具有序列特异性DNA结合特性；C－末端是碱性区，为高活性的关键区域，易形成a螺旋和转角结构，其寡聚区（第319－360氨基酸残基）所形成的二聚体或四聚体对于p53蛋白与系列特异性DNA的结合而发挥的反式激活功能具有关键作用。
P53基因的主要功能：一是作为细胞周期检查点（checkpoint）,起分子警察的作用。即细胞受损时，DNA损伤可诱导短时间p53基因的表达，p53蛋白可与DNA调控区结合，使CKI基因WAF1/CIP1（WAF1,wild-typep53transactivatedgene,CIP1,Cdk-interactingprotein）表达，其产物为p21蛋白，而p21可抑制细胞周期蛋白D激酶（CDK）活性，使cyclin-cdk不能磷酸化pRb，从而阻碍了E2F的释出，使DNA合成的有关基因不能表达，使细胞不能进入DNA合成的S期，这样损伤的细胞则停滞在G1期，为细胞DNA的修复创造条件。P53除了诱导和促进G1期阻滞外，还有观察到对某些细胞的G2期阻滞。P53基因的另一重要功能是诱导细胞凋亡。当细胞DNA损伤不能修复时，p53会诱导细胞进入编程化死亡过程。它可能通过两种途径来调控凋亡：一是通过特异性转录激活（sequencespecifictranscriptionactivation,SST）方式，p53直接激活死亡基因，如bax，或者抑制存活基因，如bcl-2。Bax比例上调，和/或bcl-2比例下调，均可促进细胞凋亡。二是p53通过非SST依赖途径起作用。P53基因对肿瘤组织有抑制作用，一是它可抑制肿瘤细胞生长，二是它可抑制肿瘤血管的生成，其机制可能是p53通过抑制血管内皮生长因子（VEGF）的作用有关。
P53基因与肿瘤细胞的热敏感性密切相关。对于携带野生型p53的细胞，加温后p53表达增加，对加温引导的凋亡效应起促进作用，对于携带突变型p53的细胞，加温后突变型p53表达也增加，与加温产生的热休克蛋白70协同，对加温引导的凋亡效应起减弱作用（7，9）。加温使肿瘤细胞产生细胞周期G1期或S期阻滞，并引发凋亡。具有正常功能的野生型p53可以增强细胞热效应,使细胞周期阻滞更延迟和凋亡比例增加，而p53缺失或变异将会减弱或失去这种作用（4、5、6、7、8、9）。
本作者采用本研究所肿瘤分子生物室构建的带有不同p53状况的4种人胃腺癌细胞，即通过脂质体介导的野生型p53基因质粒、突变型p53基因质粒、和无p53基因的空载质粒转移进有p53缺陷的人胃癌BGC－823细胞中，其中带有野生型p53的BGC823-wtp53细胞（略为W细胞），带有突变型p53的BGC823-mutp53细胞（略为M细胞），带无p53空载质粒的BGC823－vect细胞（略为neo细胞）和亲本BGC823细胞（略为823细胞），用于本实验。用FCM分析加热42°C，2h或43°C，30min后，在37°C培养下，8h或16h后，4种细胞的细胞周期再分布和凋亡的比例，结果（见图3.2.1和表3.2.1）显示在37°C对照条件下，4种细胞的细胞周期各时相比例都没有明显差异。在两种加温条件下，在37°C恢复8h或16h后，只有W细胞出现强烈的S期阻滞，在16h后出现明显的预示凋亡的Sub-G1峰，而其他3种p53异常细胞的细胞周期各时相都没有发生明显的变化，也没有出现Sub-G1峰。43°C，30min两次加温4种细胞种植肿瘤，其肿瘤相对体积曲线显示，W细胞肿瘤生长比其他3种细胞肿瘤更明显受到抑制（见图3.2.2）。以上实验结果充分说明，野生型p53促进了加温所产生的细胞周期阻滞和凋亡，从而明显地提高了肿瘤细胞的热敏感性。
图3.2.1四种胃癌细胞43°C，30min后16h流式细胞分析图
A、B、C、D为4种细胞在37°条件下16h，而E、F、G、H为43°C，30min后16h所显示的G0/G1、S、G2/M期峰的直方图。只有E图显示W细胞在43°C，30min后16h，S期峰明显增大和在G0/G1峰前出现明显的Sub－G1峰，预示凋亡出现。
表3.2.1W细胞和M细胞细胞周期各时相和凋亡的比例
只有W细胞在两种加温后8或16小时，S期比例明显增加，并出现明显的凋亡分别为10.5%和12.3%。
图3.2.243°C,20min，2次加温后四种细胞种植肿瘤抑制曲线
显示只有W细胞肿瘤受到明显抑制，到20天时仅增大了1倍，
而其他3种细胞肿瘤到20天时增大了2.7~3.6倍，生长速度显着地高于W细胞。
以上4种细胞感染腺病毒携带p53基因（Adp53）悬液，如果采用MOI（multiplicityofinfection）100的病毒剂量,可以达到细胞100％感染率和p53蛋白在细胞核内高表达，并产生细胞周期G2/M期阻滞和凋亡以及细胞增殖抑制。Adp53基因的作用不依赖于细胞内在p53状态。如果以凋亡作为热效应，Adp53基因感染W细胞或M细胞2天后结合两种加温（42°C，2h或43°C，30min）后，Adp53的热增效比，对W细胞为1.6~3.3,而对M细胞为1.8~2.1。W和M细胞裸鼠后肢种植肿瘤内注射Adp53悬液2天后，行43°C，30min加温，以肿瘤相对体积曲线显示，Adp53对W细胞肿瘤的热增效比为1.16，而对M细胞肿瘤为1.21（12）。通过这种腺病毒介导转入p53的方法是目前使用最多的基因导入的方法，我们的研究结果也证明：通过P53基因导入，可以有效地重建肿瘤细胞内变异的p53基因，通过延迟G2/M期阻滞和增加凋亡，使肿瘤细胞热敏感性明显提高，起到热增效的作用。今后我们将尝试通过肿瘤内注射Adp53悬液，结合热疗，来提高肿瘤的热疗疗效。
增强治疗基因在肿瘤细胞和组织中的表达来提高放疗、热疗和化疗的效应，是目前关注的亮点。象p53基因导入的策略一样，用腺病毒携带IL-12（interleukin-12）或TNFa感染细胞后42°C,30min加温，使IL-12或TNFa在细胞内表达13600或6.8′105倍升高。肿瘤内注射AD-IL-12后加温使肿瘤生长明显受抑制（14）。IL-12或TNFa都是适于热诱导表达的基因，它们和热疗起协同的作用。
3.3细胞凋亡
细胞死亡可以分为细胞坏死（necrosis）和细胞程序化死亡（PCD,programmedcelldeath）两种类型，,后者又称为凋亡（apoptosis）。该词源于希腊语，原意为花瓣或树叶的凋落。细胞坏死是指机体或细胞受到外界强烈的刺激，如物理的低氧、低温或高温，以及化学因素损伤时所发生的一种强烈而快速的被动性的细胞死亡过程。最早的形态学特征变化是细胞发生肿胀，胞浆和细胞器都发生肿胀，细胞膜和细胞器膜继而破溃和消失，最终被水解酶、磷酸脂酶、蛋白酶等消化殆尽。细胞核内染色质先呈为絮状，继而整体胞核发生固缩、碎裂和溶解，其变化的基础是细胞内的蛋白质的变性进而凝固，所以又被称为凝固性坏死，在水解酶的作用下坏死组织迅速液化，又可称为液化性坏死。1971年Kerr提出了有别于坏死的另一种细胞“自杀性”死亡，称为apoptosis。这是一种细胞主动的，由各种生理或病理性因素诱发或抑制的，并受各种基因调控的编程化死亡过程。它的原意是指发育过程中，定时出现的生理性刺激导致的死亡，是机体为保持细胞内环境稳定的一种自主性的清除过程,是机体内的一种生理过程。与细胞坏死过程截然不同，细胞程序化死亡在形态学上具有独特的改变。，细胞首先变圆，随即与周围细胞连接消失，微绒毛丢失，胞浆浓缩，染色质则浓缩成大小不等的半月状，并凝聚在核膜周边，再裂解为小片段，核仁裂解，进而细胞膜内陷将细胞自行分割包裹，形成外有包膜的细胞凋亡小体（apoptosisbody）。这些凋亡小体可被邻近细胞所吞噬清除。细胞凋亡的生物化学特征主要是细胞核内的DNA被核酸内切酶降解，产生若干大小不一的由180个碱基对的整倍数的寡核苷酸片段组成，如在琼脂糖凝胶电泳上检测，能观察到特征性梯状DNA条带图谱（DNAladder）。细胞凋亡过程有新的基因表达和蛋白质合成，因而也是需要能量的过程。细胞凋亡是单个细胞的事件，不发生炎症反应。凋亡起始于核内DNA的断裂，坏死起始于膜功能的改变，后期也发生细胞核内DNA降解，两种坏死以不同途径和方式，最后“异途同归”，都进入后阶段的继发性死亡（secondarynecrosis）。加温和辐射、化疗药一样，都引发细胞的凋亡，通过了解细胞凋亡的调控机制，对于增加热疗对肿瘤细胞的凋亡效应，无疑具有十分重要的意义。
凋亡过程：
细胞浓缩
核染色体浓聚成月牙形、裂解成DNA片段
细胞膜内陷分割
包裹形成凋亡小体
小体被吞噬
坏死过程：
细胞肿胀、破裂
核染色体固缩、裂解
细胞降解、碎片被
吞噬
细胞程序化死亡的机制：
发生程序化死亡的细胞发生各种生物化学以及结构的变化，最早的特征性变化即为细胞内钙离子浓度的3～5倍的升高，继而激活一些钙离子依赖性蛋白酶类，如内源性核酸内切酶（endogenousendonuclease）被激活，它从核小体（DNA双螺旋结构的基本组成单位）连接部位的DNA序列上切割开来，产生的DNA片段都是由180个碱基对的整倍数的寡核苷酸片段。除此之外，作为第二信使的环磷酸腺苷（cAMP）在细胞内浓度升高，它通过蛋白激酶A（PKA,proteinkinaseA）的介导，也参与诱导和调节细胞凋亡。细胞凋亡的最终结果都是细胞染色质DNA片段化特征性的降解，最后产生细胞碎片，形成凋亡小体，被单核－巨噬细胞、或上皮细胞，甚至为肿瘤细胞所吞噬和消化。DNA的片段化，实际上就是DNA双链断裂不能修复的最终结果，可能就是细胞的真正死因。
细胞程序化死亡是一种由基因表达调控的疾病或生理过程。细胞凋亡的调控基因主要分为两大类：一类是促进细胞程序化死亡的基因，又称为细胞自杀基因（cellsuicidegene）,其中细分为两个亚类,即细胞凋亡促进基因（apoptosis-promotinggene）和细胞增殖抑制基因（proliferation-suppressivegene），另一类是促进细胞生存的基因，又称为细胞生存基因（cellsurvivalgene）,同样也细分为两个亚类，即细胞凋亡抑制基因（apoptosis-suppressivegene）和细胞增殖促进基因（proliferation-promotinggene）。细胞的生存和死亡，就是这两类基因正负调控最后平衡的结果。如果细胞凋亡及其相关基因表达水平占上风，就决定了细胞的死亡，反之，如果细胞生存及其相关基因表达水平占上风，就决定了细胞的生存。为了提高热疗对肿瘤细胞的凋亡效应，我们可以人工地提高细胞凋亡促进基因的表达或降低细胞凋亡抑制基因，作为热疗基因调控的新靶点，这是热疗结合基因治疗的新策略。下面我们探讨一下细胞凋亡调控的几种主要基因以及它们的调控机制。（图3.3.2）
p53抑癌基因是一种直接参与细胞凋亡的蛋白质调节基因，起促进凋亡的作用。加温可以刺激细胞内p53基因的表达短暂升高。热疗诱导细胞凋亡的过程是受p53基因调控的，是一种p53依赖性的过程（4，5，6，7，8，9，10）。p53对细胞凋亡的调控可能与促进细胞膜表面受体Fas/APO1的表达相关。频发于癌细胞中的原癌基因Bcl-2基因的过表达，可以抑制野生型p53介导的细胞程序化死亡，表明bcl-2是一种细胞凋亡抑制因子，其抗凋亡机制可能与拮抗氧自由基等所引起的细胞氧化有关。Bcl-2也降低了加温产生的凋亡效应（11）。野生型p53通过其调节作用，即降低Bcl-2基因的表达和同时诱导bax基因（细胞凋亡促进基因）的表达水平升高，来诱导细胞的凋亡。P53蛋白对于bax启动子具有直接的转录激活作用，最终使bax/bcl-2的比例升高是增加细胞凋亡的关键。作为癌基因k-ras基因的产物p21/WAF1/CIP1蛋白，是细胞周期蛋白D激酶（CDK）的抑制剂，可在转录水平上被p53激活，抑制细胞G1/S期的进展，从而引发细胞凋亡，加温后也证实了p53上调WAF1而诱导凋亡的作用（8）。由此可以看出野生型p53是很重要的凋亡转录因子，也是凋亡的效应因子，如果p53发生变异，将失去以上功能，反而成为抑制凋亡的癌基因，突变型p53存在于50%以上人类肿瘤，这是肿瘤细胞热反应性降低的基因基础。
除了bcl-2之外，在生长因子缺少的条件下，原癌基因（proto-oncogene）c-myc的表达可以诱导细胞凋亡。加温诱导肿瘤坏死因子a（TNFa）表达增加，TNFa对凋亡起促进作用。
加温后诱发细胞产生凋亡，有一个引发、发展、高峰、减弱的过程，与加温温度和加温时间呈正相关关系。对于携带野生型p53的细胞，加温后p53表达增加，对加温引导的凋亡效应起促进作用，对于携带突变型p53的细胞，加温后突变型p53表达也增加，与加温产生的热休克蛋白70协同，对加温引导的凋亡效应起减弱作用（7，9）。
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